Considerații cheie de proiectare pentru protocoalele de studiu de validare a epurării virale ale produselor de terapie genetică

ICH Q5A(R2)-Fundația Internațională pentru Armonizare

ICH Q5A(R2) a fost adoptat oficial la 1 noiembrie 2023 și reprezintă documentul de orientare internațional de bază pentru evaluarea siguranței virale. În comparație cu Q5A(R1) publicat în 1999, actualizările semnificative din versiunea R2 includ: un capitol nou adăugat despre evaluarea siguranței virale în producția continuă (Capitolul 7); un rol consolidat al evaluării riscurilor ca fundament al strategiilor de eliminare virală; încorporarea secvențierii de generație următoare (NGS) în considerentele de detecție virală; și cerințe explicite pentru evaluarea produselor noi și a proceselor de fabricație. Q5A(R2) a fost adoptat de autoritățile de reglementare, inclusiv FDA, EMA și PMDA, oferind un cadru tehnic unificat pentru validarea clearance-ului viral la nivel mondial.

NMPA-Sistemul de reglementare chinez

Cadrul de reglementare NMPA pentru siguranța virală acoperă mai multe niveluri:

Nivelul documentului	Numele documentului	Anul emiterii
Document de bază	Ghid tehnice pentru eliminarea/inactivarea virusurilor din produsele din sânge	2002
Document de bază	Principii generale pentru evaluarea tehnică a evaluării siguranței virale a țesutului biologic-produselor derivate și a produselor exprimate de celule eucariote-	2005
Ghid specific-produsului	Orientări tehnice pentru cercetarea farmaceutică și evaluarea aplicațiilor de studii clinice pentru vectorul recombinant adeno-virus asociat (rAAV)-bazat în produse de terapie genică in vivo	2023
Ghid specific-produsului	Cerințe tehnice comune pentru calitatea farmaceutică a vectorului recombinant adeno-virus asociat (rAAV)-bazat în produse de terapie genică Vivo pentru cererile de autorizare de punere pe piață	2025
Ghid inovator	Orientări tehnice pentru validarea platformei proceselor de eliminare virală pentru aplicațiile din studiile clinice ale produselor proteice recombinante terapeutice (probă)a	2024

a: Acest ghid reprezintă prima dată când autoritatea de reglementare chineză a stabilit cerințe tehnice sistematice pentru validarea platformei proceselor de eliminare virală și este aliniată cu spiritul ICH Q5A(R2).

FDA și EMA-cerințe de reglementare din SUA și Europa

FDA a emis oficial un document de orientare pentru industrie bazat pe ICH Q5A(R2) în ianuarie 2024. În plus, capitolul Farmacopeea Statelor Unite (USP)<1050.1>oferă îndrumări tehnice suplimentare privind proiectarea, evaluarea și caracterizarea procedurilor de eliminare virală. FDA organizează un simpozion de eliminare virală la fiecare doi ani; simpozionul din 2023 a abordat subiecte de ultimă generație, cum ar fi modalități noi, producție continuă, medii de cromatografie noi și filtre de adsorbție. Documentele de îndrumare de bază ale EMA includ CPMP/BWP/268/95 (Notă pentru îndrumări privind studiile de validare a virusurilor: proiectarea, contribuția și interpretarea studiilor care validează inactivarea și eliminarea virusurilor) și EMEA/CHMP/BWP/398498/2005 (Orientări privind evaluarea siguranței produselor virale), ambele au fost investigate în evaluarea siguranței produselor virale. armonizat cu ICH Q5A(R2).

Identificarea surselor de contaminare virală

ICH Q5A(R2) subliniază că proiectarea validării clearance-ului viral ar trebui să se bazeze pe o evaluare cuprinzătoare a riscurilor. Pentru produsele de terapie genetică, identificarea surselor de contaminare virală ar trebui să abordeze următoarele niveluri:

Nivelul băncii de celule: Viruși endogeni (de exemplu, particule retrovirale) și viruși infecțioși latent potențial adăpostiți în substraturile celulelor de producție (de exemplu, HEK293, CHO, HeLa). Se știe că celulele HEK293 conțin secvențe endogene Ad5 E1 și un fragment EBV de aproximativ 900 bp și sunt capabile să exprime adenovirus{10}}competent de replicare; prin urmare, ar trebui să se acorde o atenție deosebită acestui risc în evaluarea riscului.

Nivelul virusului auxiliar: producția de vectori AAV utilizează de obicei metode precum transfecția triplă folosind plasmide auxiliare, care prezintă riscul de a genera-adenovirus competent de replicare (RCA). În mod similar, celulele de ambalare utilizate în producția de vectori lentivirali pot genera lentivirus-competent de replicare (RCL).

Nivelul materiilor prime: Virușii adventivi pot fi introduși prin materiile prime utilizate în producție, inclusiv mediile de cultură celulară, furajele și enzimele. Acest risc este deosebit de semnificativ atunci când sunt utilizate componente derivate-de animale (de exemplu, ser fetal bovin, soluții de digerare cu tripsină).

Diferențele de risc: Terapia genică vs. Proteinele recombinante tradiționale

Dimensiunea riscului	Produse tradiționale de proteine ​​recombinante	Produse de terapie genetică
Sursă virală	Viruși endogeni din banca de celule; virusuri accidentale	Viruși de bancă de celule; virusuri auxiliare; vectori{0}}competenți de replicare (RCV/RCL); integrarea genomului gazdei
Substratul celular	CHO, NS0, Sp2/0 și alte linii celulare bine-caracterizate	HEK293, HeLa, CHO etc.; unele linii celulare sunt de origine tumorigenă
Caracteristicile produsului	Medicament{0}}pe bază de proteine; structură bine-definită	Vector viral; prezintă riscuri de biosecuritate
Strategia de validare	Eliminarea virală în mai multe-etape; accent pe validarea etapelor procesului	Este necesară detectarea RCV/RCL; validarea și testarea ambele esențiale
Validarea platformei	Aplicabil proceselor consacrate precum S/D, pH scăzut, nanofiltrare	Aplicabilitate limitată datorită diversității tipurilor de vectori

Tabelul 1. Comparația riscurilor de siguranță virală: produse de terapie genetică vs. produse tradiționale de proteine ​​recombinate

Principii generale

Selecția virusului indicator este un element central în proiectarea protocoalelor de validare a epurării virale. ICH Q5A(R2) necesită ca selecția virusului indicator să se bazeze pe evaluarea riscului și să ia în considerare următorii factori:

Relevanța virusului pentru substratul celulei de producție (virus relevant)

Proprietățile fizico-chimice ale virusului (încapsulat/ne{0}}încapsulat, ADN/ARN, interval de dimensiuni)

Rezistența virusului la tratamente fizico-chimice

Detectabilitatea și biosecuritatea virusului

Pentru produsele de terapie genetică, selecția virusului indicator trebuie să ia în considerare în plus: rolul virusului vector în sine ca „virus relevant”; riscul potențial de contaminare cu virusul auxiliar; și cerințele de detectare și validare pentru viruși{0}}competenți de replicare (RCV/RCL).

Panoul de viruși indicator recomandat

Virus	Tip	Plic	Genomul	Dimensiune (nm)	Motivul selecției / Aplicație
MVM	Parvovirus	Nici unul	ssDNA	18–26	Model ne-învelit; cea mai mică dimensiune și cea mai mare rezistență; potrivit pentru validarea prin nanofiltrare (în general, nu se aplică pentru produsele vectoriale rAAV)
PPV	Parvovirus	Nici unul	ssDNA	18–26	Model ne-învelit; virusul indicator utilizat în mod obișnuit pentru produsele din sânge
Reo-3	Reovirus	Nici unul	ARNdc	60–80	Model ne-învelit; dimensiune medie; stabilitate fizică ridicată
PRV	Herpesviridae	Da	dsDNA	150–200	Model invelit; dimensiune mare; gamă largă de gazde
X-MuLV	Retrovirus	Da	ssRNA	80–110	Model de retrovirus învelit; adecvat pentru substraturile celulare derivate de CHO-
BVDV	Flaviviridae	Da	ssRNA	40–60	Model invelit; utilizat pentru evaluarea metodelor de inactivare chimică (surogat VHC)
VSV	Rhabdoviridae	Da	ssRNA	70	Model invelit; toleranță largă la pH; potrivite pentru validarea inactivarii cu pH scăzut-

Tabelul 2. Panoul de virus indicator recomandat pentru validarea epurării virale a produselor de terapie genetică

Considerații speciale pentru produsele AAV Vector

Pentru produsele cu vector AAV recombinant, Ghidurile tehnice ale NMPA pentru cercetarea farmaceutică și evaluarea aplicațiilor de studii clinice pentru rAAV Vector-Based In Vivo Gene Therapy Products necesită atenție pentru detectarea-AAV competente pentru replicare (rcAAV). rcAAV se referă la AAV capabil de replicare autonomă, care apare în mod obișnuit din recombinarea omoloagă între plasmida helper și genomul produs AAV. Detectarea rcAAV este în general efectuată folosind teste infecțioase sau metode qPCR, efectuate separat pe substanța medicamentoasă și produsul purificat.

Este demn de remarcat faptul că procesele de purificare din aval pentru produsele vectorului AAV includ de obicei digestia nucleazei, cromatografia (AEX), nanofiltrarea și cromatografia cu schimb ionic (CEX/IEX). În validarea tradițională a clearance-ului viral, acești pași de proces pot duce la pierderi semnificative ale vectorului AAV în sine; prin urmare, interacțiunea dintre virușii vectori și indicatorii trebuie luată în considerare cu atenție în timpul proiectării modelului de reducere-. Pentru anumite etape ale procesului (de exemplu, nanofiltrarea) în care pierderile de vector AAV sunt substanțiale, ar trebui evaluat dacă ajustările procesului sunt garantate pe baza datelor de validare (de exemplu, ajustarea dimensiunii porilor membranei de nanofiltrare).

Principii generale

Modelul scale-down (SDM) este instrumentul de bază pentru validarea epurării virale; designul său trebuie să reprezinte cu exactitate performanța de eliminare virală a procesului de fabricație. ICH Q5A(R2), Secțiunea 6.2.2, solicită în mod explicit ca modelul de reducere-să mențină coerența cu procesul de fabricație în parametrii cheie. Pentru produsele de terapie genică, următoarele considerații sunt deosebit de importante în proiectarea SDM:

Reprezentativitatea parametrilor critici de proces

Modelul redus-ar trebui să fie în concordanță cu procesul de fabricație în următorii parametri: condiții cromatografice (compoziție tampon, pH, conductivitate); raportul de încărcare (raportul masei proteinei vector/supernatant); timpul de contact și temperatura; debit/timp de rezidență; puritatea și compoziția produsului. Pentru produsele AAV, efectul distribuției dimensiunii particulelor vectoriale și al conținutului de capside goale asupra performanței nanofiltrației ar trebui, de asemenea, abordat în mod specific.

Cerințe de calificare model

ICH Q5A(R2) necesită calificarea adecvată a modelului de reducere-, inclusiv: compararea atributelor calității produsului (de exemplu, puritate, recuperare, densitate); calificarea consistenței parametrilor critici ai procesului; și asigurarea că modelul de reducere-capturează variabilitatea procesului procesului de fabricație. Pentru etapele de cromatografie, consistența profilului de vârf, eluare și spălare ar trebui să fie calificată; pentru etapele de nanofiltrare, trebuie verificate efectele capacității de volum și ale compoziției produsului.

Formula de calcul LRV

Valoarea log-reducere (LRV) este metrica de bază pentru măsurarea eficacității clearance-ului viral. ICH Q5A(R2), Secțiunea 6.5, oferă o descriere detaliată a metodelor de calcul LRV și a tratamentului statistic. Formula de calcul LRV de bază este: LRV=log₁₀(N₀/N), unde N₀ este titrul inițial al virusului după creșterea virusului și N este titrul virusului rezidual după tratarea procesului. Atunci când titrul virusului rezidual scade sub limita de detecție a testului, ar trebui utilizate metode de estimare, cum ar fi distribuția Poisson (de exemplu, testarea cu volum mare-).

Aplicarea intervalelor de încredere

Atât ICH Q5A(R2) cât și EMA CPMP/BWP/268/95 necesită evaluarea intervalului de încredere a rezultatelor calculului LRV. De obicei, se aplică un interval de încredere de 95%.

Criterii de eficacitate

Conform Ghidurilor tehnice NMPA pentru eliminarea/inactivarea virușilor din produsele sanguine, o reducere a virusului mai mare sau egală cu 4 loguri indică faptul că etapa de proces este eficientă pentru eliminarea/inactivarea virusului. Cu toate acestea, acest criteriu nu este un prag absolut și ar trebui evaluat într-o manieră holistică împreună cu curbele cinetice de inactivare, rațiunea științifică pentru selecția virusului indicator și soliditatea generală a designului protocolului de validare. Pentru produsele de terapie genetică, trebuie acordată o atenție deosebită capacității de clearance cumulative în toate etapele procesului pentru a se asigura că profilul general de siguranță virală este la un nivel acceptabil.

Aplicarea și provocările nanofiltrației

Filtrarea-retentivă a virusului (nanofiltrarea) este o etapă critică de eliminare virală în purificarea în aval a produselor de terapie genetică. Filtrele tipice-retentive de virus au o dimensiune a porilor de aproximativ 20 nm. Mecanismul de eliminare virală al nanofiltrării este în primul rând excluderea bazată pe dimensiune-și poate elimina în mod eficient majoritatea virușilor mai mari decât dimensiunea porilor membranei, inclusiv parvovirusurile mici ne-încapsulate, cum ar fi MVM și PPV.

Cu toate acestea, nanofiltrarea pentru produsele de terapie genetică se confruntă cu provocări unice: dimensiunea vectorilor AAV (aproximativ 20–26 nm) este similară cu cea a anumitor viruși indicatori (de exemplu, MVM, 18–26 nm), ceea ce poate duce la o recuperare redusă a vectorului; capsidele goale pot afecta fluxul de filtrare și eficiența retenției virale; vâscozitatea probei poate crește semnificativ cu concentrația vectorului. Prin urmare, proiectarea SDM pentru validarea nanofiltrației ar trebui să țină seama pe deplin de efectele distribuției dimensiunii particulelor vectoriale și ale conținutului de capside goală asupra performanței de filtrare și ar trebui să se ia în considerare utilizarea membranelor de nanofiltrare cu pori mai mari, după caz.

Evaluarea clearance-ului viral al etapelor de cromatografie

Cromatografia cu schimb de ioni (IEX) este o etapă de bază în procesele de purificare a produselor AAV, utilizând de obicei digestia cu nuclează urmată de cromatografia de schimb anionic (AEX) pentru a captura capside goale și defecte sau cromatografia cu schimb de cationi (CEX) pentru purificarea fină a capsidelor pline. Mecanismele de eliminare virală în etapele cromatografiei includ excluderea mărimii, interacțiunile electrostatice, interacțiunile de afinitate și alți factori. Discuțiile de la Simpozionul de eliminare virală FDA 2023 au evidențiat faptul că eficacitatea clearance-ului viral al etapelor de cromatografie este influențată de mai mulți factori, inclusiv capacitatea de încărcare, pH-ul, conductivitatea și ciclul rășinii; ar trebui adoptată o abordare de proiectare ortogonală multi-factorală pentru o evaluare cuprinzătoare.

Controlul siguranței virale în producția continuă

Noul capitol 7 din ICH Q5A(R2) stabilește cerințe specifice pentru evaluarea siguranței virale în producția continuă. Pentru produsele de terapie genetică, producția continuă a devenit o direcție importantă de dezvoltare, dar introduce și noi provocări de siguranță virală. Strategiile de control al siguranței virale în producția continuă includ:-filtre antivirus în linie ca măsuri critice de izolare; proiectarea adecvată a timpilor de rezidență și a fluxurilor de proces; incorporarea etapelor de inactivare cu timpi de retinere definiti; și aplicarea îmbunătățită a tehnologiei analitice de proces (PAT) pentru monitorizarea-în timp real a parametrilor critici ai procesului.